Kit Sintesis CDNA Strand Pertama R1011/R1012 Reverse Transcriptase Reagen PCR
Detail produk:
Tempat asal: | Cina |
Nama merek: | GDSBio |
Sertifikasi: | / |
Nomor model: | R1011/R1012 |
Syarat-syarat pembayaran & pengiriman:
Kuantitas min Order: | 1 kotak |
---|---|
Kemasan rincian: | paket kecil atau mendistribusikan massal atau OEM |
Waktu pengiriman: | 8 hari kerja |
Syarat-syarat pembayaran: | L/C, D/A, D/P, T/T, Western Union, MoneyGram |
Menyediakan kemampuan: | 100 kotak/kotak Per Hari |
Informasi Detail |
|||
Kucing. TIDAK.: | R1011/R1012 | Konsentrasi: | R1011 (20 rxns),R1012 (100 rxns) |
---|---|---|---|
Penampilan: | tanpa warna | Kelompok: | Reverse Transcriptase PCR Reagen |
Aktivitas: | Lulus | Kemampuan amplifikasi: | / |
Pencetakan Logo: | Dengan Pencetakan Logo | Paket Transportasi: | Sedang mengemas |
Kapasitas produksi: | 100 kotak/kotak Per Hari | Kondisi penyimpanan: | Simpan pada -20°C |
Cahaya Tinggi: | 20 rxns Reverse Transcriptase PCR Reagen,100 rxns Reverse Transcriptase PCR Reagen,20 rxns kit sintesis cdna untai pertama |
Deskripsi Produk
RT-PCRkit
Hanya untuk penelitian
Kucing No. R1011, 20 rxns
Kucing No. R1012, 100 rxns
Komponen kit
Komponen | R1011 (20 rxns) | R1012 (100 rxns) |
M-MLV (200U/μl) | 20 μl | 100 μl |
RNasin (40U/µl) | 12 μl | 60 μl |
Oligo(dT)15(50μM) | 20 μl | 100 μl |
Primer hexamer acak (50μM) | 20 μl | 100 μl |
5× Penyangga untai pertama | 80 μl | 400 μl |
ddH bebas RNase2HAI | 1 ml | 1 ml × 5 |
dNTP (masing-masing 10mM) | 50 μl | 250 μl |
Penyimpanan
Semua komponen kit harus disimpan pada suhu -20°C.Simpan kontrol RNA pada -70°C untuk penyimpanan lebih lama.
Ddeskripsi
Kit RT-PCR dioptimalkan untuk mensintesis cDNA untai pertama dari poli(A)+ murni atau RNA total.Kit RT-PCR untuk RT-PCR memberikan peningkatan hasil cDNA, sensitivitas tinggi, dan transkrip ukuran penuh dalam format yang nyaman.Anda mendapatkan semua komponen yang Anda butuhkan untuk sintesis cDNA untaian pertama yang sukses, menghemat waktu Anda dan memastikan kesuksesan Anda di setiap percobaan.Kit Reverse Transcriptase adalah versi M-MLV RT yang telah direkayasa untuk mengurangi aktivitas RNase H dan memberikan peningkatan stabilitas termal.Enzim ini digunakan untuk mensintesis cDNA pada kisaran suhu 42-55°C, memberikan peningkatan spesifisitas, hasil cDNA yang lebih tinggi, dan produk yang lebih lengkap daripada transkriptase balik lainnya.
Aplikasi
Sintesis cDNA untai pertama untuk RT-PCR
Konstruksi perpustakaan cDNA
RT-PCR satu langkah
ekstensi primer
SAYAcatatan penting
Menghindari kontaminasi ribonuklease
Kemurnian dan integritas RNA sangat penting untuk sintesis cDNA panjang penuh.RNA dapat terdegradasi oleh RNase A, yang merupakan kontaminan yang sangat stabil yang ditemukan di lingkungan laboratorium mana pun.Semua komponen kit telah diuji secara ketat untuk memastikan bahwa mereka bebas RNase.Untuk mencegah kontaminasi lingkungan laboratorium dan reagen, semua larutan yang disiapkan harus bebas dari RNase.Rekomendasi umum untuk menghindari kontaminasi RNase:
- DEPC-perlakukan semua tabung dan ujung pipet untuk digunakan dalam sintesis cDNA atau gunakan labware bersertifikat bebas nuklease.
- Kenakan sarung tangan saat menangani RNA dan semua reagen, karena kulit adalah sumber RNase yang umum.Ganti sarung tangan sesering mungkin.
- Gunakan reagen bebas RNase, termasuk air berkualitas tinggi (misalnya, Air yang diolah DEPC).
- Gunakan penghambat RNase, seperti Dongsheng RNasin (#R2011) untuk melindungi RNA dari aktivitas RNases.
- Jaga agar semua komponen kit tetap tertutup rapat saat tidak digunakan.Jaga agar semua tabung tertutup rapat selama reaksi transkripsi terbalik.
Templat RNA
RNA seluler total yang diisolasi dengan metode standar cocok untuk digunakan dengan kit.RNA yang dimurnikan harus bebas dari garam, ion logam, etanol dan fenol untuk menghindari penghambatan reaksi sintesis cDNA.Jejak kontaminan dapat dihilangkan dengan pengendapan etanol dari RNA diikuti dengan dua pencucian pelet dengan etanol 75% dingin.Untuk aplikasi RT-PCR, template RNA harus bebas dari kontaminasi DNA.Sebelum sintesis cDNA, RNA dapat diobati dengan DNase I untuk menghilangkan jumlah jejak DNA.DNase I harus diperoleh oleh pengguna.Selalu lakukan reaksi kontrol (RT-minus) yang mencakup semua komponen RT-PCR kecuali enzim reverse transcriptase.
Pencernaan RNase H
Sensitivitas langkah PCR dapat ditingkatkan (khususnya untuk templat panjang) dengan menghapus templat RNA dari cDNA: molekul hibrid RNA dengan pencernaan dengan RNase H setelah sintesis untai pertama.Kehadiran RNase H selama sintesis untai pertama akan menurunkan mRNA templat, menghasilkan penurunan sintesis cDNA panjang penuh dan penurunan hasil cDNA untai pertama.
Primer
Sintesis cDNA untai pertama dapat diprioritaskan dengan primer oligo(dT)15, primer acak, atau primer spesifik gen.
Sintesis cDNA bilangan prima Oligo(dT)15 dari ekor poli(A) yang terdapat pada ujung 3' mRNA eukariotik.Primer Acak memulai sintesis cDNA dari total populasi RNA (rRNA dan mRNA).Oleh karena itu, menggunakan primer acak untuk sintesis untai pertama menghasilkan kompleksitas cDNA yang dihasilkan lebih besar dibandingkan dengan primer oligo(dT)15.Akibatnya, sensitivitas dan spesifisitas reaksi PCR selanjutnya dapat dikurangi.Namun, ada beberapa aplikasi yang menguntungkan untuk menggunakan primer acak, seperti sintesis cDNA menggunakan mRNA tanpa ekor poli(A), atau sintesis cDNA menggunakan sampel RNA yang diperkaya poli(A).
Primer spesifik gen digunakan untuk mensintesis cDNA spesifik dari kumpulan RNA total atau mRNA dan harus diperoleh oleh pengguna.
Pertama- Sprosedur sintesis cDNA trand
Reaksi cDNA untai pertama dapat dilakukan sebagai reaksi individu atau sebagai serangkaian reaksi paralel dengan template RNA yang berbeda.Oleh karena itu, campuran reaksi dapat dibuat dengan menggabungkan reagen satu per satu atau campuran induk yang mengandung semua komponen kecuali RNA cetakan dapat dibuat.Bergantung pada struktur templat RNA, langkah terpisah untuk denaturasi RNA dan anil primer dapat meningkatkan hasil RT-PCR.
Protokol
SAYA.Sintesis cDNA untai pertama
1. Tambahkan reagen berikut ke dalam tabung steril bebas nuklease di atas es sesuai urutan yang ditunjukkan:
Templat RNA |
poli(A) mRNA atau RNA tertentu |
1-5 mg |
Primer |
oligo (dT)15primer atau Primer hexamer acak |
1 μl 1 μl |
air yang diolah dengan DEPC | menjadi 12,4 μl | |
Volume total | 12,4 mikrol |
2. Aduk perlahan, centrifuge sebentar dan inkubasi pada suhu 70°C selama 5 menit.Dinginkan di atas es, putar ke bawah dan letakkan kembali vial di atas es.
3. Siapkan Campuran Sintesis cDNA berikut, tambahkan komponen berikut dalam urutan yang ditunjukkan:
5× buffer untai pertama | 4 μl |
dNTP (masing-masing 10 mM) | 1 μl |
RNasin | 0,6 mikrol |
M-MLV | 1 μl |
4. Aduk perlahan dan centrifuge sebentar.
5. Untuk oligo(dT)15, inkubasi selama 60 menit pada suhu 42°C.Untuk sintesis prima hexamer acak, inkubasi selama 60 menit pada suhu 37°C.
6. Hentikan reaksi dengan memanaskan pada suhu 70°C selama 5 menit.
Produk reaksi transkripsi terbalik dapat digunakan segera dalam reaksi sintesis cDNA untai kedua atau disimpan pada suhu -20°C selama kurang dari seminggu.Untuk penyimpanan yang lebih lama, disarankan -70°C.
II.Amplifikasi PCR dari cDNA Strand Pertama
Produk sintesis cDNA untai pertama dapat digunakan langsung di PCR atau qPCR.Volume campuran reaksi sintesis cDNA untai pertama tidak boleh lebih dari 1/10 dari total volume reaksi PCR.Biasanya, 2 μl campuran reaksi sintesis cDNA untai pertama digunakan sebagai templat untuk PCR berikutnya dalam volume total 50 μl.
Dongsheng Biotech menawarkan rangkaian produk yang berbeda untuk membantu Anda mencapai kesuksesan PCR.Untuk enzim, Taq Polymerase, HS Taq DNA Polymerase, FS Taq DNA Polymerase, Pfu DNA Polymerase, dan Fusion Pfu DNA Polymerase kami memberikan kinerja PCR dengan ketelitian tinggi, efisien, dan sensitivitas.Kami juga memiliki Long Taq DNA Polymerase untuk kinerja PCR yang lama.